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SARS-CoV-2 Serology and PCR Testing

用于活性SARS-COV-2感染的准确分子试验及随后存在抗病毒抗体的血清学检测是用于对抗Covid-19大流行的关键工具。基于PCR的测试用于鉴定受感染的个体,并且血清学检测是在恢复的那些人中了解免疫应答。两种类型(用于诊断和抗体检测)的特定和敏感试验的开发是一种关键需求。

分子检测和血清学分析的研究、开发和制造是全世界许多实验室关注的焦点。Promega为实验室提供产品和定制服务,设计、执行和扩大基于PCR的分子检测,进行血清学检测和研究新的血清学检测方法。

SARS-CoV-2的PCR和血清学分析靶点

SARS-CoV-2是一种阳性的单链RNA病毒。基因组与SARS-CoV有79.6%的同源性,SARS-CoV-2病毒与ACE2细胞表面受体结合(1,2)。

SARS-CoV-2基因组编码多种结构和非结构蛋白。结构蛋白包括尖峰(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白(1,3)。

病毒刺突蛋白的结构发表在2020年2月19日的《科学》上(4)。棘突蛋白已被证明是与ACE2受体结合的位点,并且作为中和抗体的潜在靶点(5,6)和可防止粘附到靶细胞或ACE2受体内化的治疗的靶点(7,8)具有重要意义。一些病毒蛋白也成为抗病毒药物和其他治疗药物的潜在靶点(9)。

SARS-CoV-2结构蛋白

SARS-CoV-2血清学检测方法的建立

基于PCR的方法只能告诉我们在取样时病人体内是否存在病毒。他们没有提供任何关于过去感染或抗SARS-CoV-2抗体存在的信息。血清学检测需要回答这些关于个体暴露的重要问题,进行人群筛查和监测,并最终了解对这种疾病的适应性免疫反应。

目前相当多的研究致力于了解对SARS-COV-2的免疫反应,包括识别引起保护性反应的病毒抗原和发展检测抗SARS-COV-2抗体的血清学试验。

提供特异和敏感的血清学试验来证明病毒抗体的存在对于疫苗开发工作和了解个人是否安全避免再次感染至关重要。抗体测试需要能够特异性地检测SARS-CoV-2抗体,而不与其他冠状病毒发生交叉反应。

SARS-CoV-2 and the Antibody Response in COVID-19 Patients

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Ashandsoncmo公司

“世界各地的许多公司和研究团队都在致力于开发血清学检测方法,以帮助我们对抗COVID-19。任何广泛应用的检测都必须证明其敏感性和特异性,并且必须能够确定抗体水平是否对患者具有实际保护作用。”

-Ash Anderson,Promega首席医疗官

血清学分析类型

有许多冠状病毒血清学测试进入市场,每天都有新的论文发表,这有助于增加有关SARS-CoV-2免疫反应的信息。对SARS-CoV的研究和对SARS-CoV-2的一些初步研究表明,核衣壳(N)和spike(S)蛋白引起抗体反应,可能是保护性的,或者是疫苗开发的候选(5-6,14-16)。许多进入市场的测试检测到N或S蛋白的抗体(17)。一些研究已经证明,产生的针对spike蛋白的受体结合域(RBD)的抗体能够中和病毒(18-23)。有关SARS-CoV-2免疫的许多遗留问题的研究正在进行中,包括针对SARS-CoV-2的IgG抗体是否具有长期保护作用。

传统的ELISA和化学发光免疫分析(CMIA)以及护理点侧流试验(POC)是目前可用的SARS-CoV-2血清学试验的主要类型。卢米特™ Dx-SARS-CoV-2免疫分析是一种基于生物发光技术的新型检测方法,与ELISA法和侧流法相比,具有快速、可扩展的优点。

Lumit™技术-Based Test

The Lumit™ Dx SARS-CoV-2 Immunoassay uses a SARS-CoV-2-specific protein (spike protein) labeled with two subunits ofNanoBiT®技术(Lumit™ Dx CoV-2-SmBiT and Lumit™ Dx CoV-2-LgBiT). When the labeled proteins are incubated with a sample containing SARS-CoV-2 antibodies, the proteins bind to the antibody, bringing the SmBiT and LgBiT subunits into close proximity to form a functional luciferase. A bright luminescent signal is generated following the addition of the Lumit™ Dx Detection Reagent, and the signal is detected using a microplate reader.

与常规的ELISA方法不同,Lumit™DX SARS-COV-2免疫测定不需要洗涤步骤,允许更快,更可靠的样品处理。测定在96孔板中进行,并在1小时或更短的时间内产生结果。

此产品目前仅在美国提供。

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ELISA型式试验

许多ELISA或化学发光免疫测定在市场上使用病毒抗原来捕获试验样品中的抗体,许多使用SARS-COV-2穗或核衣壳蛋白作为靶标。ELISA型试验提供量化抗体反应的优点,但需要更长时间的时间,而不是护理点横向流动型试验,因为它们涉及更多的试剂加法和洗涤步骤。

这里有一个video explaining ELISA test methods.

横向流动试验

在横向流动试验中,将样品添加到含有用胶体金标记的病毒抗原的固体支撑条中,并在该条的特定部分放置抗人IgM和IgG。样本中的抗SARS-CoV-2抗体与病毒抗原结合,然后在穿过测试条时被抗人抗体捕获。出现可见的胶体金线,表明测试样品中存在IgM或IgG抗体。

这里有一个视频解释横向流量测试.

基于PCR的SARS-CoV-2检测方法

基于RT-qPCR扩增SARS-CoV-2特异序列的方法是目前用于检测活动性感染的主要方法。有针对N、E、S和RdRp序列中各种独特的SARS-CoV-2序列的测试(3,10)。使用两个或更多靶点的RT-qPCR检测可能具有更高的特异性。

世界卫生组织(世卫组织)发表了摘要信息对于一些协议,包括美国建议的协议(11)。疾病预防控制中心建议使用疾病预防控制中心2019新型冠状病毒(2019 nCoV)实时RT-PCR诊断面板对于初级诊断,其包括核衣壳(n)基因的不同区域的引物和探针加上用于检测对照/临床样品中的RNase p(RP)基因的另外的引物/探针(12,13)。

其他组织也发布了自己的工具包。2020年2月25日,Promega was recognized由Co Diagnostics,Inc.提供新产品制造支持Logix智能™ COVID-19试验,它获得了CE标志的批准,在欧洲可以作为体外诊断。

“Promega很自豪地支持疾病预防控制中心的快速反应工作,并支持COVID-19检测实验室采用经批准的扩增技术。”
Heather Tomlinson,Promega临床诊断主管

CDC COVID-19诊断面板协议的产品选项

TheGoTaq®探头一步RT qPCR系统是CDC 2019新型冠状病毒实时RT-PCR诊断面板中推荐的主混合选项,可通过FDA的紧急使用授权(EUA)获得。

为直接PCR制备样品

特快专递™ 直接扩增试剂启用直接PCR,无需事先提取RNA或DNA。这些试剂用于制备用于qPCR或RT-qPCR分析的病毒样品。

The CDC 2019-Novel Coronavirus (2019- nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel is a test protocol for detection of SARS-CoV- 2 unique sequences in respiratory specimens.

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工具书类

  1. Zhou, P.et al. (2020)与可能起源于蝙蝠的新冠状病毒有关的肺炎爆发.自然579, 270-3.
  2. 朱,N。et al.(2020)来自肺炎患者的新型冠状病毒,2019年中国肺炎.NEJM382.:, 727-33.
  3. 李,X。et al.(2020)Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19.J. Pharm。肛门。10,第2期,(4月)102-8。
  4. Wrapp, D.et al.(2020)2019-NCOV峰值的Cryo-EM结构在预防构象中.科学类,367., 1260-3.
  5. Walls, A.C.et al. (2020)SARS-COV-2穗糖蛋白的结构,功能和抗原性细胞181(2),281-292.e6页。
  6. 王,C。et al. (2020)抗SARS-CoV-2感染的人源单克隆抗体.Nat Commun11, 2251.
  7. 理查森,P。et al.(2020)巴里西尼作为2019年nCoV急性呼吸道疾病的潜在治疗药物.兰蔻395.,e30–e31(2020年)。
  8. 霍夫曼,M.et al.(2020)SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.细胞181(2),271-280.e8。
  9. 吴,r.,et al. (2020)目前治疗COVID-19的治疗药物的最新进展。Curr Pharmacol. Rep. May 11; 1‐15. doi:10.1007/s40495-020-00216-7.
  10. 科尔曼,V.M。et al.(2020)2019新型冠状病毒(2019 nCoV)的实时RT-PCR检测.Euro Surveill.,25.,10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045。
  11. 世界卫生组织PCR方案-世界卫生组织. 于2020年5月13日查阅。https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf?sfvrsn=de3a76aa\U 2。
  12. CDC 2019-新型冠状病毒(2019-NCOV)实时RT-PCR诊断面板. 查阅日期:2020年5月13日。https://www.fda.gov/media/134922/download。

  13. 2019年冠状病毒病(COVID-19):实验室常见问题查阅日期:2020年5月13日。https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/testing-laboratories.html。

  14. 田,C.et al.(2020)SARS冠状病毒特异性人单克隆抗体的2019年新型冠状病毒穗蛋白有效结合.出现。microb。感染.,9, 382-85.
  15. Ahmed, S.F.et al. (2020)基于SARS-COV免疫研究的Covid-19冠状病毒(SARS-COV-2)的潜在疫苗靶向初探。病毒12(3), 254.
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  17. Serology-based tests for COVID-19. 约翰霍普金斯大学健康安全中心。
  18. Premkumar, L.,et al.(2020)病毒棘突蛋白受体结合域是SARS-CoV-2患者抗体的免疫优势和高度特异性靶点。脊髓免疫,5, doi:10.1126/sciimmunol.abc8413 (2020).
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  20. Shi,R.,et al.(2020)一种针对SARS-CoV-2受体结合位点的人中和抗体.自然,DOI:10.1038 / S41586-020-2381-Y(2020)。
  21. Rogers, T. F.,et al.(2020)SARS-CoV-2中和抗体的分离及其在小动物模型中的预防作用.科学类(纽约州),doi:10.1126/science.abc7520(2020).
  22. 塞杜克斯,E。,et al.(2020)对一例SARS-CoV-2感染者的分析显示,在有限的体细胞突变下,产生了有效的中和抗体.免疫, doi:10.1016/j.immuni.2020.06.001 (2020).
  23. Brouwer,P.J.M。,et al.(2020)来自COVID-19患者的有效中和抗体定义了多个脆弱性靶点.科学类(纽约州),doi:10.1126/science.abc5902(2020).